La aplicación de esta proteína en un proceso clave del refinamiento tendría un favorable impacto económico y medioambiental. En la foto: Rodolfo Rasia, Luisina Di Nardo y Diego Val, integrantes del equipo de investigación que realizó el trabajo.
Especialistas del CONICET en el Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR, CONICET-UNR) y el Instituto de Procesos Biotecnológicos y Químicos de Rosario (IPROBYQ, CONICET-UNR) lograron diseñar y sintetizar una enzima fosfolipasa C termoestable, que podría brindar a nivel industrial la posibilidad de realizar el proceso de “desgomado”–necesario para el refinamiento de aceites vegetales comestibles- de manera más eficiente y económica. Los resultados publicados recientemente en la revista Biochemistry demuestran que la nueva enzima puede resistir temperaturas de hasta ochenta grados Celsius, manteniendo su actividad por más tiempo y superando a sus análogas hasta ahora disponibles. La investigación representa un caso de vinculación tecnológica exitoso entre CONICET y el sector productivo articulado a través de la empresa Keclon.
Según expresa Rodolfo Rasia, director del laboratorio de Biofísica del reconocimiento molecular en el IBR e investigador del CONICET: “Este trabajo tiene un montón de ciencia básica detrás. Hace diez años que estudiamos este tipo de enzimas, me fascina mi trabajo y cuando ese entusiasmo puede canalizarse en algo que además resulte útil, es muy gratificante”. Por su parte, en IPROBYQ “casi todas las líneas de investigación tienen un fin social o industrial”, afirma Diego Val, quien realizó sus estudios de doctorado con este trabajo en IPROBYQ con una beca del CONICET, y reconoce: “Es usual que existan estas colaboraciones con profesionales que vienen de la ciencia básica, porque para intentar dar soluciones a estas problemáticas es necesaria la visión de científicos y tecnólogos”.
De las plantas a la sartén
Los aceites de cocina se producen a partir de semillas o frutos. En Argentina el podio de la producción lo ocupan las semillas de soja, superando los cuatro millones de toneladas exportadas el pasado año. En cuanto a los frutos, las aceitunas colocan al país como el principal productor y exportador de aceite de oliva de Suramérica con unas cuarenta mil toneladas anuales.
“El aceite se obtiene a partir del prensado y extracción de las semillas” indica Rasia, y explica: “De la mezcla obtenida se separa una fase compuesta principalmente por triglicéridos –la molécula grasa más abundante en los organismos vivos- pero también contiene otro tipo de moléculas llamadas fosfolípidos –una molécula grasa que forma parte de las membranas celulares- que es importante remover para obtener el aceite refinado. El proceso para eliminarlas se conoce como desgomado”.
La forma más común de realizar este proceso consiste en mezclar el aceite con agua y someter la mezcla a ochenta grados durante treinta minutos. De la emulsión que se genera luego se separan dos fases, una acuosa que arrastra a los fosfolípidos y una fase superior menos densa que es el aceite desgomado. “El 90 % de la industria argentina realiza el proceso de desgomado solamente con agua, sin enzimas”, afirma Diego Val, y aclara que la adición de fosfolipasa al proceso puede aumentar el rendimiento de la planta de refinamiento hasta un 2,5 por ciento.
¿De dónde proviene ese aceite extra? Para entender este punto se deben conocer algunas particularidades sobre la estructura de los fosfolípidos. La molécula está formada por una parte hidrofílica, que interactúa con el agua, unida a otra parte formada por dos ácidos grasos (o sea, aceite) que no se mezcla con el agua, por ello se la denomina hidrofóbica. Entonces, cuando se realiza el proceso de desgomado, el agua interactúa con la parte hidrofílica de la molécula y eso hace que toda la molécula, incluyendo las cadenas de lípidos, sea “arrastrada” hacia la fase acuosa.
La enzima fosfolipasa C es una proteína que pueden realizar un corte preciso en la molécula del fosfolípido y separar la parte hidrofóbica de la hidrofílica, por lo que “usando estas enzimas en el proceso de desgomado permite recuperar aceite que de otra manera se perdería”, asegura Val.
Entonces ¿porque no se adicionan siempre en este proceso? El problema hasta ahora es que las fosfolipasas no resisten a temperaturas elevadas como las que se usan durante el desgomado, por lo que luego de hacer la extracción a alta temperatura, hay que enfriar la mezcla para poner las enzimas, esperar que actúen y después volver a subir la temperatura. Según explica Rasia: “Esto implica tres cosas: primero, un mayor gasto energético para subir y bajar la temperatura, segundo, que para poder hacerlo se necesita un sistema de intercambio de calor, que significa una importante inversión en infraestructura para la planta de refinamiento, y tercero, que se triplica el tiempo que tarda en realizarse el proceso”.
Por ello, Hugo Menzella, María Eugenia Castelli y Salvador Peiru, fundadores de la empresa Keclon, eran conscientes del impacto que podría tener la producción de una foslipasa C termoestable y le propusieron a Rasia colaborar en esta búsqueda. Keclon es una de las primeras empresas argentinas de biotecnología formada por investigadores del CONICET que se dedica al desarrollo y comercialización de enzimas para la industria.
La mejor por consenso
Las enzimas son estructuralmente proteínas, es decir, que están formadas por una concatenación específica de unidades más pequeñas llamadas aminoácidos. El cambio de tan solo uno de ellos puede alterar propiedades fundamentales de la enzima, como la estabilidad de su estructura 3D o su función. Para hacer una fosfolipasa C se necesitan 245 aminoácidos, pero ¿cuáles podrían determinar que resista altas temperaturas?
Para diseñar una nueva variante de esta enzima, Rasia y su equipo utilizaron una aproximación metodológica que se conoce como secuencia consenso. Para ello buscaron en más de mil secuencias de fosfolipasa C pertenecientes a distintas especies de bacterias. “Realizando un alineamiento de todas las secuencias, se busca para cada una de las 245 posiciones de aminoácido cual es el más frecuente entre todas las secuencias y ese es el elegido para esa ubicación en el diseño de la secuencia consenso”, detalla Rasia.
De esta forma, fueron definiendo uno a uno, la secuencia de aminoácidos para la síntesis de una nueva versión de la enzima fosfolipasa C. Luego debían someterla a múltiples ensayos para evaluar y comparar su performance con algunas de las variantes naturales.
“Probamos distintas temperaturas y llegamos a los ochenta grados que se usan en el proceso de desgomado acuoso”, cuenta Val y revela: “Encontramos que nuestra fosfolipasa es sustancialmente más estable a la temperatura que todas las otras, esto hace que siga activa a mayor temperatura y durante más tiempo”.
Con estos datos alentadores de los estudios in vitro, se realizaron pruebas a mayor escala que también dieron buenos resultados. Ahora Keclon se encuentra optimizando varios aspectos para su producción porque “se tiene que poder producir a gran escala y con un costo adecuado para la industria”, aclara Rasia.
Representación 3D de la estructura de la enzima fosfolipasa C termoestable diseñada por el equipo de investigación de CONICET.
La base está
Para Rasia y su equipo el trabajo no terminaba allí, pues les desvelaba poder entender por qué esta nueva secuencia de fosfolipasa C podía funcionar a temperaturas tan elevadas. Según expresa Rasia: “Entender por qué funcionó -ciencia básica- es importante, para que la próxima vez que se necesite algo similar no sea una lotería encontrarlo, que la búsqueda sea direccionada y más eficiente”.
La biotecnóloga Luisina Di Nardo, es autora del trabajo y becaria del CONICET. Como parte de su tesis doctoral estudió los aspectos biofísicos que determinan cómo se arma el sitio activo de la fosfolipasa C y cómo la enzima se une al co-factor indispensable para su funcionamiento, el elemento zinc. “Vimos que, ante la falta de zinc, la enzima diseñada por consenso es más estable que sus análogas nativas. O sea que hay una estabilidad que está dada por el propio plegamiento de la proteína y no por su unión al zinc”, cuenta Luisina.
Además, encontraron que la nueva enzima presenta otra característica inesperada que la distingue de las demás: “Sabíamos que, sometidas a temperaturas elevadas, las enzimas nativas se despliegan irreversiblemente, pero vimos que en nuestra enzima consenso el proceso de desplegado es parcialmente reversible. Se desarma y cuando la temperatura baja se vuelve a armar. Pensamos que lo que probablemente ayude a su mejor rendimiento en aceite a alta temperatura es que justamente cuenta con esta reversibilidad, de manera que siempre hay enzimas activas”, revela Rasia.
Con el fin de identificar a los aminoácidos claves para estas respuestas, sintetizaron variantes de la enzima consenso que contenía cambios puntuales de aminoácidos. Sin embargo, vieron que cualquiera de las modificaciones provocaba la pérdida de estabilidad a temperaturas elevadas. “No podemos explicar las características en la enzima consenso por uno de esos aminoácidos, sino por la ocurrencia de todos y la generación de un efecto cooperativo entre ellos que afecta a la proteína en general”, concluye Val. Por su parte Rasia reflexiona: “Es una pequeña contribución la nuestra, pero tiene un montón de ciencia básica detrás y genera conocimiento que permite proyectar hacia adelante, optimizar, simplificar y conocer en profundidad estos procesos”.Por Elizabeth Karayekov- Comunicación IBR
Referencias bibliográficas:
Val DS, Di Nardo L, Marchisio F, Peiru S, Castelli ME, Abriata LA, Menzella HG, Rasia RM. Thermal Stabilization of a Bacterial Zn(II)-Dependent Phospholipase C through Consensus Sequence Design. Biochemistry. 2024 Feb 6;63(3):348-354. doi: 10.1021/acs.biochem.3c00509. Epub 2024 Jan 11. PMID: 38206322.
Bruno Ferrari & Julio Calzada. “Se desacelera el crecimiento en la producción de aceites 2023/24 y el consumo mantiene su firmeza” AÑO XLI – Edición N° 2118 – Especial Agroindustria – 06 de octubre de 2023.
Bolsa de Comercio de Rosario en base a datos del USDA. “La producción de aceite de oliva de alta calidad se fortalece en Buenos Aires”. expoagro.com.ar, 17/08 2023.
